Анализ ДНК.

10 мкл реакционной смеси после амплификации анализировали электрофоретически в 1,5% агарозном геле. В качестве маркёров использовали ДНК фага ?, рестрицированную Bst E2, и положительный контроль ДНК N.gonorrhoae. ДНК окрашивали бромидом этидия и фотографировали при освещении ультрафиолетовыми лучами (494 нм) на трансиллюминаторе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Зарубежные литературные данные свидетельствуют, что даже при хронической гонорее выявляемость возбудителя в мазках-препаратах может достигать 81,1%, но существенно зависит от вида исследуемого материала, значительно снижаясь, например, при анализе ректальных проб (3).

В результате проведенного нами сравнительного изучения клинических образцов были установлены 2 основных морфоварианта (Рис.1 и Рис.2), наблюдаемые при световой микроскопии мазков женщин (Рис.1) и мужчин (Рис.2).

При этом показано, что у женщин в 3 из пяти случаев микроскопически обнаруживалась картина бактериального вагиноза (БВ), практически исключавшая возможность визуальной детекции диплококков (Рис.1) ввиду обилия сопутствующей грамвариабильной бактериальной флоры. Это с одной стороны могло быть связано со значительным снижением естественной резистентности слизистой, а с другой стороны - с угнетением жизнеспособности патогенов гнилостной флорой ввиду их высокой физиологической зависимости от организма хозяина, лежащей в основе способности возбудителя к факультативному внутриклеточному паразитированию.

Рис.1. Микроскопическая картина БВ (увеличение х 350)

Сравнительная характеристика проб, окрашенных различными способами, в процессе их световой микроскопии показала полную непригодность в анализируемых случаях метода Грама, поскольку делала практически невозможной дифференциацию грамположительных и грамотрицательных бактерий. Объяснение указанному, на наш взгляд, следует искать в том факте, что микроорганизмы заселяющие определенную экологическую нишу в естественных условиях принадлежат к различным "возрастным" группам. В этом случае клеточная стенка бактерий, включая пептидогликан, находится на разных этапах формирования и не всегда содержит химические вещества необходимые для прочного их связывания с генцианвиолетом и/или фуксином. В указанных случаях также необходимо учитывать давление на микроб внешних факторов (антибиотики, дезинфектанты, гормональный фон больного, уровень его иммунореактивности и.д.), каждый из которых может существенно изменить физиологическое и морфологическое состояние возбудителя.

Предложенная же нами модификация метода окраски метиленовой синью позволяла дифференцировать грамвариабельные формы бактерий, очевидно благодаря участию в окрашивании иных химических групп, что требует, однако, дальнейшего научного осмысления.

Рис.2. Микроскопическая картина мазка больной хронической атипичной формой гонореи, верифицированной методом ПЦР (увеличение х 350).

Считается, что при хронической гонорее информативность СМ повышается только в период рецидива заболевания или же при суперинфицировании больного. Вместе с тем, проведенные нами исследования показали, что выявляемость диплококков может быть связана с адекватностью восприятия обнаруживаемых фактов. Так в 7 из 10 случаев микроскопически установлена картина, не укладывающаяся в рамки общепринятых представлений о пейзаже мазков, выявляемых при СМ у больных даже хроническими формами гонореи (Рис. 2), поскольку ни в одном из них мы не обнаружили "привычного", с точки зрения отечественной литературы, лейкоцитоза. Во всех 7 положительных по СМ образцах возбудитель, не имея четкой бобовидной формы, был окружен мощной капсулой, соизмеримой с размерами клетки в целом, дифференцировался как грамотрицательный, присутствовал практически в чистой культуре, но отличался меньшими (в 2 и более раза) размерами. Это требовало увеличения разрешающей способности микроскопа (не менее х350-500 раз), создавая одновременно проблемы, связанные с необходимостью повышения интенсивности освещения.

Рис.3. Фотоснимок агарозного геля с результатами ПЦР по амплификации специфических фрагментов ДНК N.gonorrhoae (Банды 1-4 (ДНК фага l и N.gonorrhoae - положительные контроли, банды 5-14 - исследованные образцы).

Изложенные выше данные, тем не менее, не позволили нам делать серьезные научные обобщения, и послужили мотивацией к верификации полученных результатов при использовании самого современного метода диагностики - полимеразной цепной реакции. Осуществленный в соответствии с требованиями забор исследуемого материала и подготовка образцов позволили нам откорректировать первоначальные результаты и дополнительно выявить случай хронической гонореи в ситуации, когда микроскопически соответствующий результат нам зафиксировать не удалось даже после соответствующих провоцирующих воздействий. При этом, благодаря ПЦР ложноотрицательный результат был исключен у женщины даже на фоне БВ, когда вероятность диагностической ошибки наиболее высока. Более того, было показано, что метод применим для выявления атипичных и, возможно, некультивируемых форм возбудителя, являющихся наиболее частыми при хронических и атипичных формах инфекционного процесса. Это делает его незаменимым на этапе контроля излеченности и требует более широкого внедрения благодаря исключительно высокой чувствительности.

Таким образом, при исследовании клинического материала у одной из обследованных пар лабораторный диагноз был снят, тогда как в четырех случаях методом ПЦР результат был подтвержден у обоих половых партнеров на фоне отсутствия соответствующей симптоматики.

Резюмируя вышеизложенное, следует заключить, что гонорея в современных условиях претерпела существенные изменения, обусловливая возникающие на практике сложности диагностики указанных форм патологии человека, а как следствие этого - проблемы с осуществлением этиотропной терапии. В этой связи возникает необходимость пересмотра диагностических подходов в плане совершенствования традиционных методов и внедрения новых, также изменения отношения к получаемым лабораторным данным в процессе их интерпретации.

ВЫВОДЫ

1. БВ должен рассматриваться как фактор, определяющий вероятность диагностических ошибок.
2. Микроскопически продемонстрирована специфика морфологической картины, выявляемой при подозрении на хроническую гонорею.
3. Полимеразная цепная реакция обеспечивает объективный результат при атипичных и хронических формах гонореи.